はじめに
シングルセルRNAシーケンスシングルセル RNA シーケンス (scRNA-seq) は、次世代シーケンス を使用して、特定のサンプルの個々の細胞内の RNA 分子の発現を測定する技術です。 解析（single cell RNARNA (Ribonucleic acid) はすべての細胞に存在する一本鎖核酸で、窒素塩基とリン酸基に結合したリボース糖であるヌクレオチドで構成されています。 sequencing, scRNA-seq）は、個々の細胞内のRNA分子を高分解能かつゲノムスケールで記述するための重要な技術です。細胞の不均一性の解消、希少な細胞集団の同定と特性解析など多くの用途に使用され、生物医学分野の発見と革新に有用な分子情報をもたらしています（Haque et al.、2017）。
NovogeneにおけるscRNA-seqの仕様
Novogeneでは、scRNA-seqのワークフローに10x GenomicsのChromium ControllerとIlluminaのNovoSeq 6000シーケンスシステムを使用しています。scRNA-seqワークフローのステップの詳細は次のセクションで説明します。表1に、scRNA-seqを実行するためのイルミナのNovoSeq 6000シーケンスシステムの仕様を示します。
表1. scRNA-seq用のIlluminaのNovoSeq 6000シーケンスシステムの仕様 (Novogene、 2011a)。
NovogeneにおけるscRNA-seqのワークフロー
Novogene における10x Genomics社のChromium ControllerプラットフォームとイルミナのNovoSeqシーケンスシステムを用いたscRNA-seqの一般的なワークフローを図1に示します。
図1. Novogeneが提供するscRNA-seqの一般的なワークフロー。
ステップ1：サンプルの調製
scRNA-seqの最初のステップは、機械的分離、酵素的消化、またはその2つの組み合わせによって、目的の組織から生存可能な単一細胞を分離することです（図1a）。サンプルは凍結保存懸濁液でも新鮮懸濁液でもよいです（Novogene、2011a）。
ステップ 2: 単一細胞ライブラリーの調製
単一細胞のパーティショニングとバーコード化
10x Genomics社のChromiumコントローラーは液滴ベースのシステムで、マイクロ流体で単一細胞をパーティショニングし、バーコード化された 次世代シーケンス次世代シーケンス（NGS、Next generation sequencing) は、ゲノム全体、あるいはDNAやRNAの標的領域のヌクレオチドの順序を同時に決定できる強力な技術です。 （NGS） cDNAcDNA (complementary DNA) は、RNA 分子を鋳型として逆転写によって合成される DNA 配列です。 ライブラリーNGSを行う場合に創るやつ。 を調製することができます（図1b-i）。ChromiumプラットフォームはNext GEMテクノロジー（図1b-ii）によって駆動され、このテクノロジーの中核としてゲルビーズが使用されています。各ゲルビーズには、目的のRNA分子を捕捉するために、ユニークなオリゴヌクレオチドバーコード配列とアッセイ特異的な機能化配列がコーティングされています（10x Genomics、2023）（図1b-ii）。
単一細胞のパーティショニングは、バーコード付き オリゴヌクレオチドヌクレオチド数が少なく、短くて直鎖状のDNAまたはRNA 、細胞、 逆転写RNAテンプレートからDNAを合成するプロセス。 （Reverse transcription、RT）試薬、パーティショニングオイルを含むゲルビーズをマイクロ流体チップにロードすることから始まります（図1c-i）。その後、チップを10x Genomics社のChromiumコントローラーに入れ、Gel Beads in emulsion (GEMs)と呼ばれる反応小胞を形成させます（図1c-ii）。クロミウム反応中、バーコード化されたゲルビーズは細胞および試薬と結合し、その後パーティションオイルと結合してチップ内にGEMを形成します（図1c-iii）。各GEMは、1個の細胞、1個のゲルビーズ、およびRT試薬を含む個々の反応液滴として機能します。GEMがチップの回収ウェルに形成されると（図1c-iii）、それらは回収されます（図1c-iv）。GEMの約65%は単一細胞と単一ゲルビーズを含みます（10x Genomics、2023）。
単一細胞の溶解と逆転写（RT）
各GEM反応ベシクル内でゲルビーズを溶解し、単一細胞を溶解し、核酸と同一にバーコード化されたRTオリゴヌクレオチドを溶液中に放出します（図1d-i）。その後、各GEM内でRTが行われ、 mRNAmRNA (Messenger RNA) は、細胞にタンパク質を作るように指示する一本鎖 RNA の一種です。 がバーコード化されたcDNAに変換されます（図1d-ii）。その結果、単一細胞からの全てのcDNAは同じバーコードを持つことになり、シーケンスリードを元の単一細胞にマッピングすることができます（10x Genomics、2023）。
cDNA増幅と単一細胞ライブラリー構築
RT後、分配オイルを除去し、バーコード付きcDNAを増幅のためにプールし（図1d-iii）、バルクでライブラリーを構築します（図1d-iv）。シーケンシングリードライブラリーを作製した後（図1e-i）、シーケンシングを行うことができます（図1e-ii）（10x Genomics、2023）。
ステップ3：シーケンス
ライブラリーはフローセルにロードされ、バルクRNA-seqに使用されるものと同様の、イルミナのNovoSeq 6000シーケンスシステムにセットされます。イルミナのシーケンステクノロジーは、クラスター生成と合成化学によるシーケンスにより、1つのフローセル上で数百万から数十億のクラスターをシーケンスします。シーケンス中、各クラスターについて、装置上のソフトウェアによってシーケンスのサイクルごとにベースコールが行われ、保存されます。塩基コールデータは、シーケンス終了後に解析できます（図1e-ii）（Novogene、2011b）。
ステップ4：データ分析
シーケンス後、装置のソフトウェアがヌクレオチドを識別し（ベースコールとして知られるプロセス）、これらのベースコールの信頼性と質を決定します。データは、標準的な解析ツールにシーケンスデータをインポートすることで解析できます。scRNA-seqデータの技術的ばらつきも評価されます（図1f）。
参考文献
Haque, A., Engel, J., Teichmann, S.A., et al. (2017). A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med, 9, 75. doi: 10.1186/s13073-017-0467-4. https://doi.org/10.1186/s13073-017-0467-4
Illumina. (2023). Single cell RNA-seq: An introductory overview and tools for getting started. Illumina, Inc. https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started
Novogene. (2011a). Introduction to single cell sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/transcriptome-sequencing/single-cell-sequencing/#
Novogene. (2011b). A basic guide to RNA-sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/a-basic-guide-to-rna-sequencing/
10x Genomics. (2023). Inside Chromium next GEM technology. 10x Genomics. https://pages.10xgenomics.com/rs/446-PBO-704/images/10x_LIT025_Inside-Chromium-Next-GEM-Technology_Letter_Digital.pdf