このテクニカルノートは、さまざまな RNAシーケンス次世代シーケンスを用いてサンプル中のRNAの量や配列を調べる技術。 （RNA-sequencing、RNA-seq）プラットフォームに関する情報を提供します。
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Novogeneで利用可能なRNA-seqテクノロジーを表2に示します。イルミナNovaSeq 6000は、すべてのタイプのRNA分子をシーケンスできるショートリードシーケンスを提供しますが、Pacific Biosciences (PacBio) Sequel/II/Iie および Oxford Nanopore Technologies (ONT) のPromethIONプラットフォームは、個々の RNARNA (Ribonucleic acid) はすべての細胞に存在する一本鎖核酸で、窒素塩基とリン酸基に結合したリボース糖であるヌクレオチドで構成されています。 分子のロングリードシーケンスを提供します。これは、polyAテールを含む真核生物のmRNA分子のシーケンスにのみ使用できます (表1) (Novogene、2011)。
ロングリードシーケンシングには、完全長の転写物を取得できる（したがってショートリードアセンブリが不要）、PCRバイアスや入力RNAの断片化を防止できるなどの利点がありますが、欠点もあります。不利な点には、高いエラー率、大規模なサンプル要件、および定量化にショートリードシーケンスデータを使用する必要性が含まれます (Novogene、2011)。
表1. Novogeneが提供するさまざまなRNA-seqプラットフォーム。
| Illumina1, 2 | PacBio4 | ONT5 | ||
| NovaSeq 60003 | Sequel | Sequel II/ IIe | PromethION | |
| 平均リード長DNA 断片から配列決定された塩基対 （basepair、bp)）の数。6 | 2 x 250 bp | 10 – 30 kb | 10 – 30 kb | up to > 4 Mb |
| 精度7 | ≥75% Q30+ | >Q20 consensus | >Q30 consensus>Q10 single | >Q30 consensus>Q20 single |
| 出力8 | 6 Tb | ~15 Gb | ~100 Gb | 14 Tb |
| リード数9 | 20B | 50K | 4M | 1M |
| Gbあたりのコスト10 | 低い | 高い | 高い | |
| RNA分子のタイプ11 | 500bpまでの全タイプのRNA | polyAのついたmRNAのみ | polyAのついたmRNAのみ | |
1(Illumina (2023a).
2(Illumina (2023b).
3Illumina (2023c).
4PacBio (2023).
5Oxford Nanopore Technologies (2008).
6平均リード長とは、DNAフラグメントからシーケンスされた塩基対の数です。
7精度とは、塩基が誤ってコール/シーケンシングされる確率の尺度です。特定の塩基のシーケンス精度スコアQは、「Q = -10log10(e)」という式で計算されます（ここで、eはベースコールが正しくない推定確率です）。Qスコアが高いほど、エラーの確率が低くなります。例えば、品質スコア20（Q20）は、100分の1のエラー率（すなわち、100bpのシーケンスリードごとに1つのエラーが見つかる）を表し、対応するコール精度は99％であることを示しています。シーケンス品質がQ30の場合、1000分の1のエラー率を表すため、ほとんどすべての読み取りが正しく、エラーやあいまいさはありません。さらに、「≥75% Q30+」は、エラー率が1000分の1未満の塩基の≥75%を表します(Q30+)（Illumina, 2023d）。
8出力とは、シーケンスの結果として生成されるデータの量です。
9リード数とは、分析に入る読み取りの総数を指します。これは、使用されるシーケンスライブラリとフローセルの数に依存します。
10Zhou (2022).
11Novogene (2011).
参考文献
Illumina. (2023a). Illumina sequencing platforms. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms.html
Illumina. (2023b). Technology: platform. Illumina, Inc. https://www.novogene.com/us-en/technology/platforms/
Illumina. (2023c). Specifications for the NovaSeq system. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq/specifications.html
Illumina. (2023d). Measuring sequencing accuracy. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/quality-scores.html
Novogene. (2011). A basic guide to RNA-sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/a-basic-guide-to-rna-sequencing/
Oxford Nanopore Technologies. (2008). Product specifications. Oxford Nanopore Technologies plc. https://nanoporetech.com/products/specifications#comparison[tab]=specifications
PacBio. (2023). Sequel systems. PacBio. https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/sequel-system/