従来のライブラリ構築アプローチとTwistの異変体ライブラリの違い

はじめに

異変体ライブラリー とは、与えられた DNA 配列の、わずかですが正確に異なるバージョンであるバリアントのコレクションです。通常、DNA配列（図1a）はタンパク質構造（図1b）に変換され、タンパク質としての機能を発揮します（図1c）。現代の科学はDNAレベルでさまざまなことができます。しかしながら、DNA配列からタンパク質の構造を正確に予測することはできません。また、タンパク質の構造からDNA配列を予測することもできません。あるいはタンパク質の構造からタンパク質の機能を完璧に予測することはできませんし、その逆もまた真です。DNAの塩基配列、タンパク質の構造、およびその機能の間の関係をハイスループットで完全に理解するための系統的アプローチは、異変体ライブラリーを使用することです（Willems、2023）。異変体ライブラリーは、 ランダム変異誘発法 （例えば、 エラー・プローン・ポリメラーゼ連鎖反応 （epPCR））、 部位特異的変異誘発法 （site directed mutagenesis）、 コンビナトリアル変異誘発法 （combinatorial mutagenesis）（例えば、NNK、TRIM）など、多くの従来の方法によって構築することができます。しかし、これらの方法には弱点や限界があるため、Twist BioscienceはシリコンベースのDNA合成プラットフォームを開発し、そのような制限なしに異変体ライブラリーを構築できるようにしました。このテクニカルノートでは、ライブラリーを構築する従来のアプローチとTwistが提供するアプローチの違いを説明します。

図1. 異変体ライブラリーの使用法を示す概略図（Willems、2023からの改変）。

ライブラリを構築する従来のアプローチ

ランダム変異誘発

ランダム変異誘発は、DNA配列全体にランダムに 変異 を導入する技術です。これによってDNA配列全体に幅広い変異が生成され、多様な バリアント の大規模なプールが得られます。いったんバリアントが開発されれば、これらのライブラリーは構造・機能研究や 指向性進化 研究を含む多くの目的に使用することができます。ランダム突然変異誘発法は他の突然変異誘発法とは異なり、研究者が標的とするDNA配列の構造的特性に関する予備知識を必要としないため、新規変異や有益な変異を偏りなく発見することができます。このため、ランダム変異誘発法は、タンパク質が細胞内で果たす機能や、折り畳み安定性や凝集傾向などの物理的特性の影響を受けてどのように進化するかを調べるタンパク質進化研究に特に有用です（Agozzino & Dill、2018; Forloni et al.、2018）。

ランダム変異誘発によって遺伝的多様性を生み出す方法は数多くあり、DNAや菌体全体を様々な化学変異原で処理する方法、クローン化した遺伝子をミューテーター株に通す方法、epPCR変異誘発法、ローリングサークルepPCR法、飽和変異誘発法などがあります（Labrou、2010）。最も一般的に用いられているランダム変異誘発法はepPCRです。図2にepPCRプロセスの概要を示します。この手法は標準的なPCRを基に開発されました。標準的なPCR反応では、ポリメラーゼによるDNAの複製は非常に特異的です。しかし、epPCRでは低忠実度 DNAポリメラーゼ やその他の人工ポリメラーゼを用いるため、 DNA重合 を行う際にランダムにミスペアが挿入されます（図2a, b）。変異はまた、Mn2+やMg2+の濃度を高めたり、不均等なdNTP濃度（例えば、gGTPやdATPに対して不均等な濃度のcCTPやdTTP）を使用するなど、PCR反応の理想的でない条件を作り出すことによっても促進されます（Jimenez-Rosales & Flores-Merino、2018）。DNAセグメントに沿った散発的な変異塩基（図2b, cの赤いヌクレオチド）は、異なるコード化 コドン のランダム変異を促進します。変性DNA配列が生成された後（図2c）、epPCRは最後のサイクルまで続けられ（図2d）、その後、 ベクター にさらにライゲーションするための制限部位を導入するために、部位特異的変異誘発が行われます（図2e、f）。

図2. epPCRプロセスの概要。

部位特異的突然変異誘発

部位特異的突然変異誘発法が開発される以前は、突然変異はすべてランダムであり、科学者は目的の突然変異を見つけるために、目的の表現型に対するスクリーニングと選択を行わなければなりませんでした。ランダム突然変異誘発では、どのヌクレオチドを変化させるかをあまりコントロールできないため、研究者たちは、選択された変化を正確かつ部位特異的にDNAに導入する方法を見出してきました。その一つが部位特異的突然変異誘発であり、二本鎖DNAや プラスミド のある領域、あるいは異なる領域内の特定の位置、あるいは連続したアミノ酸に変異を与える方法です。遺伝子やタンパク質の構造と機能の関係を研究したり、クローニングや発現戦略を容易にするためにベクター配列を変更したりするなど、特定のDNA改変（挿入、欠失、置換）を行う理由は数多くあります（Agilent Technologies、2023）。

図3に部位特異的突然変異誘発法の概要を示します。この手法では、二本鎖DNAテンプレート、高忠実度DNAポリメラーゼ、および必要な変異を含むカスタム設計のオリゴヌクレオチドDNA プライマー を使用する必要があります（図3a-i）。変異原性プライマーは、変異部位の周囲で鋳型DNAと相補的であるため、DNAとハイブリダイズし、目的の遺伝子への変異導入を容易にします。プライマーは、NNN（Nは任意のヌクレオチド）またはNNK（KはTまたはGのいずれか）というコドン（図2a-i、iii、ivの赤色X）で指定されたコドンで縮退します。変異は、単一の塩基変化（点変異）、複数の塩基変化、欠失、挿入のいずれでもよいです。

最初のステップは、変異鎖合成を複数回行うための サーマルサイクリング 手順です（図3a）。熱サイクリング中、DNA鋳型は変性し（図3a-ii）、変異原性プライマーは変性した鋳型DNAにアニールします（図3a-iii）。次にDNAポリメラーゼが変異原性プライマーを伸長し、片方の鎖に変異を持つ二本鎖DNA分子を生成します（図3a-iv）。熱サイクリングが完了すると、メチル化およびヘミメチル化DNAに特異的な 制限エンドヌクレアーゼ Dpn Iで処理し、親DNA鋳型を消化します（図3b）。消化後、変異した一本鎖DNAをコンピテント細胞に形質転換することができます（図3c）（Agilent Technologies、2023; Jimenez-Rosales & Flores-Merino、2018）。

図3. 部位特異的突然変異誘発プロセスの概要（Agilent Technologies、2023より改変）。

コンビナトリアル変異誘発

コンビナトリアル変異誘発は、DNA配列内の複数の位置を同時に変異させる部位特異的手法であり、各変異体には複数の変異が含まれています。この方法は、タンパク質の機能に対する多数の変異の組み合わせ効果を評価するのに有用です。部位特異的変異誘発と同様に、コンビナトリアル変異誘発で使用されるプライマーもまた、NNN（Nは任意のヌクレオチド）またはNNK（KはTまたはGのいずれか）のコドンで指定されたコドンで縮退されます（Jimenez-Rosales & Flores-Merino、2018）。

従来のライブラリ構築アプローチとTwistの異変体ライブラリの比較

ライブラリーを構築する従来の方法には弱点と限界があり、不正確な比率のバリアントの生成、コドンの使用に関する制限された制御、バリアントの多様性の不均一な分布、 ストップコドン や望ましくないモチーフの存在などに悩まされ、これらすべてが下流のプロセスに影響を与える可能性があるため、配列空間の限られた偏ったサンプリングにつながります。これらの制限のために、ライブラリーの全バリエーションを捕捉するためには、高価で非効率的なスクリーニングを何度も繰り返す必要があります（Willems、2023）。

一方、TwistのシリコンベースのDNA合成プラットフォームでは、バリアントが塩基ごとにデザイン入力を反映してプリントされるため、従来のアプローチのランダム性に代わって、高精度、多様性、均一性のライブラリーが正確に合成されます。このプラットフォームを利用することで、特にコドンの使用率（全64コドンが利用可能）、アミノ酸の分布、長さのばらつきを制御しながら、ユーザーが定義した比率で望ましいバリアントが生成されるため、個々のバリアントの表現の過不足についての心配はありません（Willems、2023）。さらに、ストップコドンや不要なコドン、不要な制限部位、不要なジペプチドモチーフがないように、DNA配列を完全に制御することができます。表1は、Twistの異変体ライブラリーと従来のアプローチで作製されたライブラリーの違いを示しています。

表1. Twistの異変体ライブラリーと従来のアプローチで構築されたライブラリーの比較（Twist Bioscience、2023）。

epPCR NNK/NNSTrim/Trimer 制御Twistの異変体ライブラリー
シーケンスバイアスを排除×××Yes
利用可能なコドンの数不明3220すべて64
不要なモチーフを除去×××○
コドンの最適化が可能×××○
ストップコドンの回避××○○
NGS QC検証×××○

Twistの異変体ライブラリー作製

Twistでは、異変体ライブラリーはまず、シリコンベースのDNA合成技術（図4bの挿入図）を用いて、一本鎖 オリゴヌクレオチド （オリゴ）の集合体である オリゴプール （図4b）から合成されます。この技術は、96ウェルプレートと同じフットプリントのシリコンチップを使い、一度に100万種類のオリゴ配列を生産します。各シリコン・チップは数千の個別のクラスターを含み、各クラスターはユニークなオリゴ配列（図4bの挿入部）を合成できる121の個別にアドレス可能な表面を含みます。合成されたオリゴ（図4c）は、シリコンチップ上で完全にカスタマイズされたユーザー定義のバリアントライブラリーを構築するために使用されます。部位飽和ライブラリー（図4d）、コンビナトリアルバリアントライブラリー（図4e）、SOLDライブラリー（図4f）の3種類のライブラリーを作ることができます。ライブラリーが生成されると、ベクターにクローン化され、微生物に増殖され、目的の配列についてスクリーニングされ（図4g）、個別にNGS配列決定され（図4h）、顧客に出荷する前に、すべての目的のバリアントが正しい比率で存在することが確認されます（図4i）。

図4. Twistの異変体ライブラリー生産の概要。

参考文献

Agilent Technologies. (2023). QuikChange multi site-directed mutagenesis kit. Agilent Technologies.  https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/200514.pdf

Agozzino, L., Dill, K. A. (2018). Protein evolution speed depends on its stability and abundance and on chaperone concentrations. Proc Natl Acad Sci U S A., 11;115(37): 9092-9097. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30150386/

Forloni, M., Liu, A. Y., Wajapeyee, N. (2018). Random Mutagenesis Using Error-Prone DNA Polymerases. Cold Spring Harb Protoc, 2018(3). doi: 10.1101/pdb.prot097741. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29496818/

Jimenez-Rosales, A., Flores-Merino, M.V. (2018). Tailoring Proteins to Re-Evolve Nature: A Short Review. Mol Biotechnol, 60, 946–974. https://doi.org/10.1007/s12033-018-0122-3

Labrou, E. N. (2010). Random mutagenesis methods for in vitro directed enzyme evolution. Curr Protein Pept Sci, 11(1). https://dx.doi.org/10.2174/138920310790274617

Twist Bioscience. (2023). Variant libraries. Twist Bioscience. https://twistbioscience.yokohama/pdf/Brochure_Libraries_2OCT20_Rev1.0_1.pdf

Willems, B. (2023). Twist DNA variant libraries [PowerPoint slides]. Twist Bioscience.