このテクニカルノートでは、 DNAシーケンスDNA 内のヌクレオチドまたは塩基の正確な配列を決定する技術。 のアプリケーションとDNAシーケンスのワークフローに関する情報を提供しています。
関連記事 DNAシーケンスの世代の違い
DNADNAは 「deoxyribonucleic acid」の略で(デオキシリボ核酸)、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 Moreシーケンスの応用
DNAシーケンス技術は、さまざまな研究課題に答えるために使用することができ、使用するアプローチは、研究に関わるパラメータと必要な情報の種類によって異なります(Novogene、2011a)。図1は、各DNAシーケンサーのアプリケーションの概要を示しています。
![](https://www.astride.jp/wp-content/uploads/2023/08/Picture6-1024x487.png)
図1. さまざまなDNAシーケンスのアプリケーションの概要(Novogene、2011aから改変)。
ホールゲノムシーケンス (Whole genome sequencing、WGSWGS (Whole genome sequencing、ホールゲノムシーケンス)は生物の全ゲノムの塩基の並び順を解析する技術です。)
WGS は、サンプル中のタンパク質コード領域と非コードDNA領域を含む全ゲノムを、30倍を超える深さのシーケンスで包括的に解析するものです。ヒト、動物、植物、微生物のゲノムをシーケンスし、ゲノムの様々な変異生物のゲノムの核酸配列の変化。を同定するために使用することができます(Novogene、2011a)。
De novoシーケンスとresequencingは、WGSの2つの主要なアプローチです。 De novoシーケンスアラインメント用の参照配列がない新規ゲノムの配列決定技術。 は、アライメントに利用できる参照配列がない新規ゲノムをマッピングするために使用されます。一方、再シーケンスは、 一塩基変異一塩基変異(Single nucleotide variant、SNV)は集団のDNA配列またはゲノムにおける一塩基の変異です。 (Single nucleotide variants、SNV)、 挿入突然変異の一種で、DNAセグメントに1つ以上のヌクレオチドが付加されます。 、 欠失DNA セグメントから 1 つ以上のヌクレオチドが失われる突然変異の一種。 、 転座染色体が壊れ、断片化した断片が別の染色体に再結合する際のプロセス。 などの遺伝子変異を特定するために、アライメントのための参照配列を使用してゲノムを調査します(Illumina、2023a;Novogene、2011a)。
ホールエクソームシーケンス (Whole exome sequencing、WESWES (Whole exome sequencing、ホールエクソームシーケン))はゲノム内の遺伝子のすべてのタンパク質コード領域の配列を決定する技術です。)
WES は、ゲノムのタンパク質コード領域(またはエクソーム)のみを、50~100倍以上の深さのシーケンスで調べます。WGSと比較すると、生成されるデータ量が大幅に少ないため、シーケンスや解析のコストが低くなります。また、WESはWGSよりも精度が高い。エクソームはゲノムの2%未満に過ぎませんが、既知の疾患関連遺伝子変異の85%が含まれており、疾患の遺伝的原因の特定に有用です(Delanne et al、2021; Illumina、2023a)。
ターゲット領域シーケンス(Target region sequencing、TRSTRS (Target region sequencing 、ターゲット領域のシーケンス)はゲノム内の特定の関心領域の配列を決定する技術です。)
TRS は、特定の機能を持つゲノムの特定の領域、例えば、疾患や特定の表現型に関連する可能性が高い領域に焦点を当てます。変異の解析や希少なバリアントの同定に有用です。TRSは、WGSやWESと比較して、はるかに高い深度(500倍以上)でのシーケンスが可能であり、費用対効果が高いのが特長です(Novogene、2011b)。
TRSにはハイブリダイゼーションキャプチャーとアンプリコンシーケンスの2種類があり、その違いは表1に示す通りです。
表1. ハイブリダイゼーションキャプチャーとアンプリコンシーケンスの比較(Novogene、2011a)。
![](https://www.astride.jp/wp-content/uploads/2023/08/Picture7-1024x364.png)
WGS、WES、TRSの仕様は図2に示す通りです。
![](https://www.astride.jp/wp-content/uploads/2023/08/Picture8.png)
図2. WGS、WES、TRSの比較。SNP = Single nucleotide variant、一塩基変異、InDel = Insertions and deletion、挿入と欠失、SV = Structural variant、構造変異、CNV = Copy number variant、コピー数変異コピー数変異(Copy number variant、CNV)はゲノムの一部が繰り返され、その数が個体によって異なる変異体です。 (Novogene、2011a).
メタゲノムシーケンス
メタゲノムシーケンス微生物群集の全ゲノムを網羅的に解析する技術。 は、微生物群集の全ゲノムを網羅的に解析することができます。これにより、微生物の多様性を評価し、これらのコミュニティ内の微生物を検出することができます。アンプリコンシーケンスとショットガンシーケンスは、メタゲノムシーケンスの2つのタイプです(Illumina、2023c; Novogene、2011a)。
エピジェネティック・シーケンスDNA配列変化以外のメカニズムによる遺伝子活性の変化を研究する技術。
エピジェネティック・シーケンス とは、遺伝子型を変えずに、環境の結果として遺伝子の表現型に起こる変化を研究するものです。エピジェネティックシーケンスには、DNAメチル化を対象とする全ゲノムビスルファイトシーケンス、ヒストン修飾や 転写因子DNAをRNAに転写する過程に関与するタンパク質。 を調べるクロマチン免疫沈降シーケンス(ChiP-seq)、RNA-タンパク質相互作用を解析するRNA免疫沈降シーケンス(RIP-seq)などの技術があります (Novogene、2011a).
DNAシーケンスのワークフロー
DNAシーケンスのワークフローは、4つのステップで構成されています(図3)。
ステップ1:サンプルの準備
DNAシーケンスは、細胞培養、新鮮凍結組織、ホルマリン固定パラフィン包埋(Formalin-fixed paraffin-embedded、FFPE)組織、血液、唾液、骨髄など、DNAまたは cDNAcDNA (complementary DNA) は、RNA 分子を鋳型として逆転写によって合成される DNA 配列です。 を生成するあらゆるサンプルに対して実行できます(図3a)。
ステップ2:ライブラリーの作成
DNAサンプルがシーケンサーと互換性を持つようにするために、 ライブラリーNGSを行う場合に創るやつ。 を作成します。シーケンスライブラリーは通常、DNAを断片化し、断片の両端に専用の アダプター他の DNA または RNA 分子の末端に連結できる、化学合成された短い一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド。 をライゲーションすることで作成します(図3b)。その後、断片を増幅し、精製します(Illumina、2023b)。
ステップ3:シーケンス
ライブラリーはフローセルにロードされ、シーケンサーに乗せられます。DNA断片のライブラリーは、クラスター生成として知られるプロセスで増幅され、数百万コピーの一本鎖DNAが得られます(Illumina、2023b)。第2世代シーケンサーまたはSBSのプロセスが行われ、詳細はこのテクニカルノートの以前のセクションで説明されています(図3c)。
ステップ4:データ解析
シーケンス後、装置ソフトウェアが ヌクレオチド窒素塩基と糖およびリン酸基が結合した化合物。ヌクレオチドはDNAなどの核酸の基本構造単位を形成します。 を特定し(ベースコールと呼ばれるプロセス)、そのベースコールの予測精度を確認します(図3d)。データは、標準的な解析ツールにシーケンスデータをインポートすることで解析することができます。
![](https://www.astride.jp/wp-content/uploads/2023/10/Picture51-1024x697.png)
図3. 典型的なDNAシーケンスのワークフロー。
参考文献
Delanne, J., Bruel, A.L., Huet, F., et al. (2021). The diagnostic rate of inherited metabolic disorders by exome sequencing in a cohort of 547 individuals with developmental disorders. Mol. Genet, 29: 100812. doi: 10.1016/j.ymgmr.2021.100812. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34712575/
Illumina. (2023a). What is whole-genome sequencing. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/whole-genome-sequencing.html
Illumina. (2023b). Main steps in next-generation sequencing. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/beginners/ngs-workflow.html
Illumina. (2023c). What is shotgun metagenomic sequencing. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/areas-of-interest/microbiology/microbial-sequencing-methods/shotgun-metagenomic-sequencing.html
Novogene. (2011a). A beginner’s guide to DNA sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/a-beginners-guide-to-dna-sequencing-blog/
Novogene. (2011b). What is target region sequencing?. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/genome-sequencing/target-capture-sequencing/target-region-sequencing-trs/