クローン化オリゴプールベクターにクローニングされた二本鎖オリゴヌクレオチド。 は、 ベクター生物内で安定的に維持できる小さなDNA断片で、クローニングの目的で外来DNA断片を挿入することができます。 にクローン化された二本鎖オリゴです。オリゴプールの品質は実験の成功にとって非常に重要です。特に、オリゴプール合成中 (図 1b) あるいはクローン作成 (図1 d) のエラーは、オリゴプールの品質に影響を及ぼし、不正確な配列を引き起こす可能性があります。エラーを修正することは可能ですが（たとえば、ターゲットのヒットを検証するために下流の次世代シーケンス次世代シーケンス（NGS、Next generation sequencing) は、ゲノム全体、あるいはDNAやRNAの標的領域のヌクレオチドの順序を同時に決定できる強力な技術です。（NGS）をさらに実行することによって）、コストと時間がかかる可能性があります。エラーを最小限に抑え、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction、 PCRPCR（Polymerase chain reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）は、変性、オリゴヌクレオチドのアニーリング、および DNA ポリメラーゼ伸長のサイクルを繰り返すことによる核酸配列の酵素的増幅を伴う技術です。 ）増幅条件をテストし、増幅に最適なポリメラーゼとプライマーペアを選択し、クローニング ワークフローを設計するという面倒な手順を回避するために、Twist Bioscienceは最適化されたクローニング プロセスを開発しました。（Twist Bioscience、2023）。 このプロセスには、クローニング戦略の設計、シリコンプラットフォーム上での非常に均一で正確なオリゴプールの合成 (図 1b)、オリゴプールの増幅 (図 1c)、クローン作成 (図 1d)、オリゴプールとNGS検証 (図 1f) が含まれます。この最適化されたクローニングプロセスにより、Twist Bioscienceは、元の合成オリゴプールの高い均一性と精度を維持する信頼性の高いクローニングと、プールの均一性とドロップアウトに関するNGS品質管理データをお客様に提供します。
図1. Twist Bioscienceの最適化されたクローン作成プロセスのワークフロー。 Twist Bioscienceによってクローン化されたオリゴプールが作成されるまで (g)、お客様はTwist Bioscienceに目的のオリゴ配列 (a) を提供するだけでよく、その他の手順 (b ～ f) はTwist Bioscienceが担当します。 (a) お客様によるオリゴプールライブラリの設計。 (b) Twist Bioscienceによるシリコン プラットフォーム上での合成およびクローニング戦略の設計、ならびにオリゴ プールの合成。お客様がカスタマイズされたベクターを必要とする場合、ベクターエンジニアリングはTwist Bioscienceによって実行されます。 (c) オリゴプールの増幅。 (d) オリゴプールをクローニングして、(e) クローン化オリゴプールを形成する。 (f) NGS 検証と品質管理。 (g) 高品質のクローン化オリゴプールを受け取ると、お客様は直接実験を行うことができます。
Twist Bioscienceによって作成されたクローン化オリゴプールの均一性を、線形増幅オリゴ プールライブラリーの均一性と比較して評価しました。この実験では、15,154個の異なるオリゴを含むオリゴプールが合成され、増幅されました。次に、増幅されたプールをカスタマイズされたベクターにクローン化し、クローニング前とクローニング後の増幅オリゴプールの均一性を確認するためにNGSを実施しました。均一性だけでなく、配列完全オリゴの割合とドロップアウトの割合も測定されました。配列完全オリゴとは、設計されたオリゴプールと完全に一致する配列の割合を指します。 ドロップアウトオリゴプールで観察されなかった設計配列の割合。 とは、オリゴプール内で観察されなかった設計配列の割合を指します（Twist Bioscience、2023）。 クローニング前後の増幅オリゴプール間のNGSデータを図 2に示します。結果は、クローニング後のオリゴプールの配列完全オリゴのパーセンテージ (つまり、エラーなしで表されたオリゴの割合) が＞96%であったことを示しています。クローニング前後の増幅オリゴプールのドロップアウト測定値は両方ともゼロで、2 つの90/10パーセンタイル比の差は0.1でした。両方のオリゴプールは均一な分布を示しました(図 2)。したがって、これらの結果は、Twist Bioscienceによるオリゴプールのクローニングが、元の線状オリゴプールの高い均一性と精度を維持したことを示しています。
図2. 増幅オリゴプールのクローニング前 (A) とクローニング後 (B)でのNGSデータの比較。右側の表では次のようになります。「% Oligos represented without error」とは、設計したオリゴプールと完全に一致する配列の割合のことです。「Dropouts」とはオリゴプールで観察されなかった設計配列の割合、「Diversity」は設計オリゴプールに含まれるユニークな配列の総数のことです。
参考文献
Twist Bioscience. (2023). Cloned Oligo Pools. Twist Bioscience. https://www.twistbioscience.com/resources/product-sheet/twist-cloned-oligo-pools